聚合酶链反应技术简称PCR技术,是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术,可检出微量靶序列(甚至少到1个拷贝)。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板,在一对引物介导下,在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步:变性、退火及延伸。以上三步为一循环,每一循环的产物作为下一个的模板,这样经过九小时的循环,每一循环的产物作为下一个循环的模板,这样经过数上时的循环后,可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共进行30次循环左右,最后再延伸72℃5分钟,4℃冷却终止反应。
1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。
2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。
3.多重PCR(multiples PCR)在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长,发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。
4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。
5.反向PCR(iverse polymerase chain reaction)对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。
6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度,以得到单链DNA并进行列测定,以了解目的基因的序列。
7.锚定PCR(anchored polymerase chain reaction)帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序,将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上,在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下,将未知序列扩增出来。
8.着色互补试验或荧光PCR(color complementation assay or fluorescent PCR)原理是用不同荧光染粒,分别标记于不同寡核苷酸引物上,同时扩增多个DNA片段,反应完毕后,利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物,就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合,如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合,如果某一DNA区带缺失,则会缺乏相应的颜色。
9.双温PCR(two-temperature PCR)仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。
上述这些PCR技术的应用:
(1)PCR技术扩增特定序列为基础,采用多种方法进行检测,如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针;
(2)通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针;通过选择性扩增cDNA中的特殊片段,产生针对尚未克隆的基因的探针;
(3)从微量mRNA中产生cDNA文库;
(4)产生大量用于序列分析的DNA;
(5)分析 基因突变;
(6)做染色体步移。
10.原位PCR技术:PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA,但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位,因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系,这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力,但由于其敏感性问题,尤其是在石蜡切片中,尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR(In situ PCR,简称IS PCR),它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位,从而弥补了PCR和原位杂交的不足,具有良好的应用前景。目前,已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世,使操作简便,软件灵活,已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。