病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具,病毒载体的优点有:
(1)在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分;
(2)在可能将有有制陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究;
(3)能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分 ,并能进分离;
(4)转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。
逆转录病毒载体 逆转录病毒辣为RNA病毒,它们的基因组编码在一条单链RNA他妇上,病毒进入细胞通过逆转录作用,病毒RNA即转变为双链DNA分子,DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中,这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列(LTR),LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序,包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMV和SV。
DNA病毒载体 主要有腺病毒相关病毒载体,腺端正毒载体,
病毒载体。对DNA病毒载体的研究是当前基因基因治疗研究中的重点领域。
常用的基因转染技术
将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,并在细胞内表达。转染方法有多种,根据不同的细胞,贴壁或悬浮细所可选用不同的方法,其目的是要达到设置转染效率,影响转染产率的因素有多种,包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等,下面重点介绍向几种常用的转染技术:
靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞,其生长状态如何,将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞,也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
靶基因质粒DNA的准备 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其了化学物质的污染,OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准,目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。
具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及
电击
基因转导尘等。靶基因被导入细胞后,一般在转染后48小时,靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系,则可对靶细胞进行筛选,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。
转基因动物的建立和应用
转基因动物是以实验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内,使其稳定整合和遗传给后代动物。它主要采用显微注射法、逆转录病毒载体感染法、精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法。
转基因动物模型的建立,推动了肿瘤在分子水平上的研究,它使人们认识到激活的原癌基因的异常表达及功能失常,是肿瘤发生的初阶段。将癌基因与特定细胞的调控序列连在一起,可使癌基因在特定细胞中表达,研究靶细胞对不同癌基因的易感性,阐明某一癌基因对特定 细胞生长、分化及功能的影响;它还可以研究多种基因的协同作用,有助于对多步骤致癌机进行深和的探讨。
转基因小鼠不但用以研究癌基因的功能,还可以通过使某一基因功能丢失(如用基因剔除技术)研究抑癌基因在肿瘤发一中的作用。另外,转基因小鼠对致癌原的测试,为肿瘤的预防,治疗及发现新的致癌物质都提供了有价值研究工具。